一、二步法
1. 原理
为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶--免疫球蛋白结合物。
2. 标记步骤
（1）称取HRP25mg溶于1.25%溶液中，于室温静置过夜。
（2）反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml/1分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。
（3）将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。
（4）用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3小时。
（5）加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。
（6）在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃ 1小时。
（7）3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，zui后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。
（8）将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PBS缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。
3. 结果判定
（1）定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。zui后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定( 见本节 (三)工作浓度的选择)。
（2）定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程1cm)。
酶量(mg/ml)＝OD403nm×0.4
IgG量(mg/ml)＝(OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62抗体
（3）本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有2-4%的酶与蛋白质结合。
